Gen, vad är det för fel på dig?

CRISPR-Cas9-teknik väcker mycket uppmärksamhet från både forskare och alla som är intresserade av bioteknik. Många tror att en ny metod för exakt genredigering kommer att skapa den perfekta människan i framtiden.

I början av februari 2016 blev det känt att den brittiska regeringen hade tillåtit forskare att ändra DNA från mänskliga embryon för forskningsändamål med CRISPR-systemet. Vi pratar inte om skapandet av GMO-människor, eftersom alla modifierade embryon som erhållits genom in vitro-befruktning kommer att förstöras efter 14 dagar.

Men allmänheten var mycket orolig. Till exempel sa chefen för USA: s nationella underrättelsetjänst, James Clapper, att potentiellt genomredigerande teknik är massförstörelsevapen. Hans pessimistiska prognos förkroppsligades i den nya säsongen av serien "The X-Files", där CRISPR-systemet användes för globalt folkmord. Vad är CRISPR-teknik, varför orsakar den så stor spänning bland forskare, rädsla bland allmänheten och vad kan den verkligen ge mänskligheten?

Antivirusskydd

CRISPR är immunsystemet hos bakterier och arkeea som räddar mikroorganismer från virus. Det upptäcktes först av japanska forskare i slutet av 1980-talet i bakterien Escherichia coli (Escherichia coli). De märkte att det bakteriella genomet innehåller repetitiva sekvenser åtskilda av distanser - unika regioner. Men vilken roll allt detta utför, kunde de inte räkna ut. En liknande genetisk kassettstruktur hittades senare i en annan mikroorganism - archaea Haloferax mediterranei, och sedan i många andra prokaryoter. Sådana områden blev kända som akronymen CRISPR, det vill säga Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. På ryska - "korta palindromiska repetitioner, ordnade regelbundet i grupper."

Mer än tio år senare har genetiker fastställt att bredvid CRISPR-kassetter finns gener som kodar proteiner som kallas Cas. Kända distansorgan har jämförts med DNA-sekvenser från omfattande genomiska databaser. Det visade sig att distansorganen är mycket lika regionerna i genomet av bakteriofagvirus, liksom plasmider - cirkulära DNA-molekyler som vanligtvis finns i bakterier.

En grupp bioinformatik som leds av Evgeny Kunin från National Center for Biotechnological Information föreslog mekanismen för drift av CRISPR-kassetter och tillhörande Cas-proteiner. Ett virus som har kommit in i en bakteriecell detekteras av ett komplex av Cas-proteiner som bär en distanssekvens. Om det senare sammanfaller med en del av virusets DNA (protospacer), skär Cas-proteiner det främmande DNA: t och förhindrar infektion. Senare kunde forskare sätta in en distans med ett fragment av bakteriofaggenomet i bakteriens CRISPR-kassett och observerade hur mikroorganismen lyckades hantera viruset. Detta fungerade som ett av bevisen på den föreslagna hypotesen.

Distanser i CRISPR-kassetter är en mall för produktion av crRNA, som skickas tillsammans med Cas-proteiner för att attackera viruset. Var kommer distanserna från? När en bakterie stöter på ett okänt virus börjar den skära olika bitar av DNA från sina egna och främmande genom och sätta in dem i kassetten. Naturligtvis är de flesta av dessa bitar värdelösa och till och med skadliga, men den som hjälper kroppen att bekämpa infektionen förblir i CRISPR och överförs till bakteriens efterkommande.

Genomträngande det heligaste

Det visade sig att det finns flera varianter av CRISPR-Cas-systemet. En av dem kodar inte Cas-proteinkomplexet, utan bara en - Cas9. Detta är en universell molekyl som utför flera funktioner samtidigt: den binder främmande DNA och skär det. Det var i systemet med Cas9-proteinet som forskare såg ett exakt genomredigeringsverktyg. I en artikel som publicerades i tidskriften Science 2012 föreslog Emmanuelle Charpentier och Jennifer Doudna artificiella sekvenser som crRNA som skulle känna igen vissa delar av DNA. Då skulle Cas9 göra nedskärningar där forskare behöver det. En annan forskargrupp visade samtidigt att CRISPR-Cas9-systemet kan arbeta med genom inte bara i bakterier utan även i celler från andra organismer, inklusive människor.

Och före CRISPR-systemet var genomredigeringsmetoder kända. Till exempel med hjälp av nukleaser som innehåller zinkfingrar. Dessa är artificiella enzymer som inte finns i naturen och som kan klyva DNA-kedjan. Zinkfinger är en speciell proteinmodul som innehåller en eller flera zinkjoner. Det är med hjälp av sådana strukturer som enzymer interagerar med DNA, RNA och andra molekyler. Forskarna kopplade zinkfingret till en annan modul som skär genom DNA-strängen. Sådana nukleaser kan vara inriktade på specifika regioner i genomet, där skärningar görs. Problemet är att för varje plats där en paus måste göras måste ett specifikt protein syntetiseras, isoleras och testas. Dessutom är användningen av nukleaser förknippad med stor sannolikhet för fel: ofta uppstod brott på fel platser.

CRISPR-Cas-systemet är mycket bekvämare. Skärningens funktion tas över av Cas9-proteinet, vilket är detsamma för alla mållokaliteter. Allt som behöver göras är att syntetisera ett crRNA som kommer att berätta för proteinet exakt var man ska göra ett dubbelsträngsbrott. När pausen har gjorts aktiveras DNA-reparationssystem. För det första är det mekanismen för icke-homolog ändförening (NHEJ), vilket resulterar i olika mutationer som stör generens funktion. Om du gör många av dessa avbrott, kan du uppnå omläggningen av en stor del av DNA.

För det andra - homolog rekombination (HR), när liknande eller identiska DNA-regioner utbyter nukleotidsekvenser med varandra. Denna mekanism används för att reparera skador på en dubbelsträng som kallas dubbelsträngsbrott.

När det gäller guidad DNA-redigering är homolog rekombination mer lämplig för forskare. Med CRISPR-Cas-systemet kan pauser göras för att ta bort en hel region från DNA. Samtidigt släpper genetiker den sekvens de har skapat, som är inbäddad i stället för den raderade. Det är således möjligt att "reparera" mutationer som orsakar allvarliga sjukdomar. Forskare tar bort den defekta delen av genen och ersätter den med en normal. Dessutom är det möjligt att införa nya mutationer, skapa olika varianter av samma gen, lägga till specifika sekvenser till den, vilket påverkar funktionerna hos det protein som kodas av den.

Många defekta gener kan korrigeras på en gång. För att göra detta behöver du bara syntetisera motsvarande crRNA, vars sekvenser sammanfaller med de nödvändiga DNA-regionerna. Cas9-proteiner binder till crRNA och strävar efter att "reparera" gener. Det bör klargöras att när vi pratar om en matchning menar vi en kompletterande matchning. Principen om komplementaritet visar i vilket fall bindningar kommer att bildas mellan olika strängar av DNA eller RNA. Nukleotid A binder till nukleotid T och nukleotid C till G. Därför matchar till exempel ACTG-fragmentet TGAC.

Vapen mot sjukdom

När det blev klart att CRISPR-systemet kunde användas för att redigera det mänskliga genomet började många laboratorier runt om i världen aktiv forskning. Till exempel använder de teknik för att skapa genetiskt modifierade organismer. En av riktningarna är skapandet av mjölksyrabakterier som kan motstå attacken av bakteriofager som förstör kulturerna av fördelaktiga mikroorganismer. Men kanske en av de mest intressanta användningarna av CRISPR är i kampen mot retrovirala infektioner.

Retrovirus - som HIV - infogar sitt genom direkt i DNA i en infekterad cell. Tidskriften Scientific Reports har publicerat en uppsats som visar hur användningen av CRISPR-Cas9 kan rena HIV-infekterade T-lymfocyter och till och med förhindra återinsättning av viruset. Genetiker introducerade helt enkelt gener som kodar för crRNA och Cas9 i odlingen av T-celler, som i sin tur framgångsrikt skördade virus-DNA från lymfocytgenomet.

Kinesiska forskare genomförde experiment på mänskliga embryon redan innan sådana studier tilläts i Storbritannien. I april 2016 rapporterade genetiker att de hade förändrat embryongenen för att göra dem immun mot HIV. Med hjälp av CRISPR introducerade de en gen som finns hos människor som är immun mot infektion.

CRISPR-systemet har också kommit till nytta i kampen mot cancer. I ett arbete som publicerades i Nature Biotechnology visades det till exempel att man med ett modifierat Cas9-protein kan stänga av vissa gener och därigenom bestämma deras roll i omvandlingen av normala celler till maligna. Om det visar sig att en mutation i en viss gen bidrar till utvecklingen av cancer, är nästa steg att korrigera defekten med genetisk manipulation.

CRISPR kan hjälpa till att behandla blodcancer - leukemi. Istället för att leta efter en benmärgsgivare kan du ta vävnadsprover från patientens hematopoetiska organ, korrigera defekta stamceller, befria dem från den dödliga mutationen och sedan transplantera dem tillbaka. Om de maligna cellerna som finns kvar i den sjuka kroppen förstörs av strålning kommer de reparerade cellerna att kunna föröka sig och producera friska blodkroppar.

Pandoras låda

Är CRISPR farligt? På den nuvarande utvecklingsnivån, nr. Rädslor är till stor del relaterade till det faktum att det är för tidigt att redigera det mänskliga genomet för att behandla ärftliga sjukdomar. Tekniken är fortfarande rå. Således har kinesiska forskares arbete kritiserats för det stora antalet DNA-avbrott som har uppstått på fel plats. Dessutom hade bara ett fåtal av de femtio embryona en korrekt ersättning av genstället.

Om genomredigeringsteknik kommer att rädda mänskligheten från ärftliga sjukdomar, cancer, virus, så är detta en framtidsfråga, som kanske är mycket längre än optimister tror. När det gäller att skapa bättre människor och de etiska frågor som medföljer det är det i allmänhet bortom vad CRISPR kan göra.